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微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程
一、目的：建立微生物限度檢查的基本操作規(guī)程，為微生物檢查人員提供正確的操作規(guī)程。
二、適用范圍：適用于品管化驗(yàn)室的微生物限度檢查。
三、職責(zé)：品管微生物檢驗(yàn)員對本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施負(fù)責(zé)。
四、正文：
1定義：微生物限度檢查法：系指非規(guī)定滅菌制劑及其原輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。2實(shí)驗(yàn)用具：
電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水溫箱、試管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、試管架、注射器、針頭、注射器盒、研缽、75%酒精棉球、紫外燈（365nm波長）。
3培養(yǎng)基：
3.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、乳糖膽鹽培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基。
3.2培養(yǎng)基的管理、配制應(yīng)符合檢定菌、培養(yǎng)基管理規(guī)程、培養(yǎng)基配制規(guī)程。
4試液：甲基紅試液、a-奈酚乙醇試液、40%氫氧化鉀溶液、靛基質(zhì)試液。
5稀釋劑：0.9%無菌氯化鈉溶液。
6供試品溶液的制備：取供試品（供試品如為固體，置研缽中研磨成細(xì)粉）放入試管中，加入適量的稀釋劑制成1：10濃度的供試品溶液。
7對照用菌液：控制菌檢查均應(yīng)作相應(yīng)已知菌的對照試驗(yàn)，對照菌株為大腸桿菌[CMCC（B）441022]。取相應(yīng)菌株的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18-20小時(shí)，稀釋至1：106，對照菌的加入量為50-100個(gè)。
8檢查法：
8.1除另有規(guī)定外，細(xì)菌的培養(yǎng)溫度為30-35℃，霉菌的培養(yǎng)溫度為
25-28℃，控制菌的培養(yǎng)溫度為35±1℃。
8.2細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)：
8.2.1平皿菌落計(jì)數(shù)法取均勻供試液，進(jìn)一步稀釋成1：102、1：103等適宜的稀釋級(jí)。分別取連續(xù)三級(jí)10倍稀釋的供試液各1ml，置直徑約90mm的平皿中，再注入約45℃的培養(yǎng)基約15ml，混勻，等凝固后，倒置培養(yǎng)，每個(gè)稀釋級(jí)應(yīng)作2~3個(gè)平皿。
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計(jì)數(shù)。
8.2.2菌數(shù)測定陰性對照試驗(yàn)取供試驗(yàn)用的稀釋劑各1ml，置4個(gè)無菌平皿中，分別按細(xì)菌、霉菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)，檢查，不得長菌。
8.2.3細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)，分別在24小時(shí)及48小時(shí)點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以48小時(shí)菌落數(shù)為準(zhǔn)，霉菌培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)，分別在48小時(shí)及72小時(shí)點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以72小時(shí)菌落數(shù)為準(zhǔn)。菌落如蔓延生長成片，不宜計(jì)數(shù)。
8.2.4點(diǎn)計(jì)后，計(jì)算各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。
8.2.5菌數(shù)報(bào)告規(guī)則：細(xì)菌宜選取平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋級(jí)，霉菌宜選取平均菌落數(shù)在30-100之間的稀釋級(jí)，作為報(bào)告菌數(shù)計(jì)算的依據(jù)。如只有1個(gè)稀釋級(jí)菌落數(shù)在30-300（30-100）
之間時(shí)，將該稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告，如同時(shí)有兩個(gè)稀釋級(jí)在30-300（30-100）之間時(shí)，按下式計(jì)算兩級(jí)比值。
比值=低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)
高稀釋級(jí)平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)
.當(dāng)比值≤2時(shí)，以兩稀釋級(jí)的均值報(bào)告，當(dāng)比值＞2時(shí)以低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告，如同時(shí)有3個(gè)稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均在30-300（30-100）之間時(shí)，以后兩個(gè)稀釋級(jí)計(jì)算級(jí)間比值，如各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均不在30-300（30-100）之間，以最接近30或300的稀釋級(jí)平均菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告，如各稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均在300（100）以上，按最高稀釋級(jí)菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告，如各
稀釋級(jí)平均菌落數(shù)均小于30時(shí)，一般按最低稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告，如當(dāng)1：10（1：100）稀釋級(jí)平均菌落數(shù)等于或大于原液（或1：10）時(shí)，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法測定，按測定結(jié)果報(bào)告菌數(shù)。
8.2.6培養(yǎng)基稀釋法：取供試液（原液或1：10供試液）3份，每份各1ml，分別注入5個(gè)平皿內(nèi)（每皿各0.2ml）每個(gè)平皿中傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，每1ml注入的5個(gè)平板點(diǎn)計(jì)的菌落數(shù)之和即為每1ml的菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)，以3份供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。
如各稀釋級(jí)平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)小于1時(shí)，則報(bào)告菌數(shù)為小于10個(gè)。
8.3控制菌檢查除另有規(guī)定外，取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、cm2），直接或處理后接種，經(jīng)增菌、分離培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭氏染色、生化試驗(yàn)等項(xiàng)檢查。
8.3.1大腸菌群：
8.3.1.1檢樣稀釋及培養(yǎng)
�、僖詿o菌操作，將檢樣25g（ml）放于含有225ml滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠），經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好在均質(zhì)器中以8000—10000r/min的速度處理1min，作成1：10的均勻稀釋液。
�、谟�1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖不要接觸管內(nèi)稀釋液），混合均勻，做成1：100的稀釋液。
�、哿砣�1ml滅菌吸管，按上述操作順序，做10倍遞增稀釋液。如此每次遞增稀釋一次，即換用一支1ml滅菌吸管。
�、芨鶕�(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或標(biāo)本污染情況的估計(jì)，選擇3個(gè)合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管。
8.3.1.2乳糖發(fā)酵試驗(yàn)
將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，用雙
料乳糖膽鹽發(fā)酵管，
1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種三管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。
8.3.1.3分離培養(yǎng)
將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18~24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。
8.3.1.4證實(shí)試驗(yàn)
在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1~2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。
8.3.1.5報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。
9結(jié)果判斷：
9.1細(xì)菌菌落數(shù)、霉菌菌落數(shù)、控制菌三項(xiàng)均符合該品種微生物限度項(xiàng)下的規(guī)定，應(yīng)判為供試品符合規(guī)定；其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下規(guī)定，應(yīng)判供試品不符合規(guī)定。
9.2細(xì)菌菌落數(shù)、霉菌菌落數(shù)第一次測定超過該品種項(xiàng)下微生物限度規(guī)定時(shí)，應(yīng)從同一批號(hào)樣品中隨機(jī)抽樣，復(fù)試兩次，以三次結(jié)果平均值報(bào)告。
9.3如營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上生長霉菌菌落數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上生長細(xì)菌菌落數(shù)超過該品種項(xiàng)下微生物限度規(guī)定時(shí)，經(jīng)復(fù)試2次，如3次結(jié)果平均值仍超過規(guī)定，應(yīng)判為供試品不符合規(guī)定。
9.4各類制劑檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按第一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再抽樣復(fù)試，即應(yīng)判該供試品不符合規(guī)定。
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